十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種常用的蛋白電泳。經(jīng)典SDS-PAGE蛋白電泳凝膠，由兩種不同濃度的丙烯酰胺溶液形成的不連續(xù)凝膠（濃縮膠和分離膠）。
1、凝膠材質(zhì)
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結(jié)合使用。 交聯(lián)劑雙丙烯酰胺含有兩個(gè)單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反應(yīng)-通常由過硫酸銨(APS)引發(fā)。在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。
蛋白電泳，通常采用30%或30%+(%T)的聚丙烯酰胺凝膠。通過改變基質(zhì)的百分比來調(diào)整孔徑大小，從而有效分離不同大小的蛋白。聚丙烯酰胺凝膠的含量與蛋白大小成反比。
分離膠中丙烯酰胺比例和分離蛋白大小的關(guān)系
| 丙烯酰胺比例 |
8% |
10% |
12.5% |
15% |
20% |
| 分離蛋白范圍 |
25-200 KDa |
15-100 KDa |
10-70 KDa |
6-60 KDa |
4-40 KDa |
2、變性劑
SDS是一種陰離子去污劑。SDS-PAGE蛋白電泳中,SDS與蛋白質(zhì)緊密集合,將蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開,引起蛋白質(zhì)構(gòu)想的改變,其所帶的電荷與蛋白質(zhì)有大大的差異,因此消除或掩蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷。電泳時(shí)的蛋白的遷移率就不在受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響,而只與蛋白質(zhì)大小有關(guān)。
常用SDS-PAGE蛋白電泳分離膠和濃縮膠配置表
| 溶液成分（mL) |
5%濃縮膠 |
不同濃度的分離膠 |
| |
|
6% |
8% |
10% |
12% |
15% |
| 水 |
6.8 |
20 |
16.7 |
13.3 |
10 |
5 |
| 30%Acr-Bis(29:1) |
1.7 |
10 |
13.3 |
16.7 |
20 |
25 |
| 1M Tris(pH=8.8） |
- |
19 |
19 |
19 |
19 |
19 |
| 1M Tris(pH=6.8） |
1.25 |
- |
- |
- |
- |
- |
| 10% SDS |
0.1 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
| 10% 過硫酸按 |
0.1 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
| TEMED |
0.01 |
0.04 |
0.03 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
| 總體積（mL) |
10 |
50 |
50 |
50 |
50 |
50 |
凝膠配置試劑
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| A108470 |
丙烯酰胺 |
電泳專用級(jí) |
79-06-1 |
25g,100g,500g |
| M104026 |
N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺 |
電泳級(jí), ≥99.0% (T) |
110-26-9 |
25g,100g,500g |
| T105496 |
四甲基乙二胺(TEMED) |
用于電泳,99% |
110-18-9 |
25ml，100ml |
| A112447 |
過硫酸銨APS |
99.99% metals basis |
7727-54-0 |
25g,100g,500g |
| S108346 |
十二烷基硫酸鈉(SDS) |
電泳專用,≥98.5% (GC) |
151-21-3 |
25g,100g,500g，2.5Kg |
3、電泳緩沖液
經(jīng)典SDS-PAGE蛋白電泳緩沖體系（Tris Glycine）工作原理：
上層濃縮膠，由較低濃度丙烯酰胺溶液形成（一般丙烯酰胺濃度為4-6%）。濃縮膠體系中的氯離子（Cl-）作為先導(dǎo)離子，以較快的速度向正極遷移。在其后面形成一個(gè)電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，加快了蛋白質(zhì)和甘氨酸離子（Gly)的遷移。由于濃縮膠中的pH較低（一般pH=6.8），甘氨酸的負(fù)離子效應(yīng)不明顯，作為尾隨離子，遷移較慢。所以，進(jìn)入分離膠之前，蛋白堆積在氯離子、甘氨酸離子之間，有利于提高電泳的分辨率。
進(jìn)入下層分離膠后，pH升高(分離膠通常pH=8.8)，使甘氨酸解離成負(fù)離子效應(yīng)增加，使甘氨酸的遷移超過蛋白質(zhì)。另外，由于分離膠中的丙烯酰胺濃度明顯高于濃縮膠，一般丙烯酰胺濃度為8-15%。蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其性質(zhì)分離。在非變性蛋白凝膠電泳中，按荷質(zhì)比分離蛋白。在SDS-PAGE變性蛋白凝膠電泳，按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)。
Tris Glycine緩沖體系電泳緩沖液組分
| 組分 |
Tris base |
甘氨酸 |
SDS |
去離子水 |
(pH 8.3) |
| 濃度 |
25 mM |
192mM |
0.10% |
— |
|
電泳緩沖液配置試劑
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| T110601 |
三(羥甲基)氨基甲烷 |
分子生物學(xué)級(jí),≥99.9%(T) |
77-86-1 |
500g，1Kg |
| A110752 |
甘氨酸 |
用于電泳,≥99% |
56-40-6 |
500g，2.5Kg |
| S108346 |
十二烷基硫酸鈉(SDS) |
電泳專用,≥98.5% (GC) |
151-21-3 |
25g,100g,500g，2.5Kg |
除了(Tris-甘氨酸)緩沖系統(tǒng)，聚丙烯凝膠蛋白電泳緩沖系統(tǒng)也衍生出了一系列進(jìn)化緩沖系統(tǒng)。Tricine緩沖系統(tǒng)中，用Tricine替代了傳統(tǒng)Tris-甘氨酸系統(tǒng)中的甘氨酸，使得低分子量蛋白（2-20 kDa）電泳具有更高的分辨率。Tris-醋酸鹽凝膠可以用于大分子量蛋白（＜500 kDa）的分離。
4、蛋白染料
考馬斯亮藍(lán)R250染料是SDS-PAGE中最常用的蛋白染色之一。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在549納米處有最大的吸收。每個(gè)正電荷氨基酸約1.5-3個(gè)考馬斯亮藍(lán)R250分子將被結(jié)合。靈敏度在200-400ng左右。而考馬斯亮藍(lán)G250主要應(yīng)用是Bradford法(測(cè)定蛋白質(zhì)濃度)，但也可以對(duì)聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。
蛋白染料
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| C298550 |
考馬斯亮藍(lán)染色液 |
- |
- |
100ml |
| C298551 |
考馬斯亮藍(lán)快速染色液 |
0.1%（W/V） |
- |
100ml |
| B105005 |
考馬斯亮藍(lán)R250 |
電泳級(jí),≥90 %(HPLC) |
6104-59-2 |
5g,25g,100g |
| B104241 |
考馬斯亮藍(lán)G250 |
70%,用于電泳 |
6104-58-1 |
5g,10g,50g,250g |
| C298552 |
考馬斯亮藍(lán)脫色液
(40%甲醇，10%冰醋酸) |
- |
- |
100ml |
5、上樣緩沖液
上樣緩沖液通常包含密度成分、SDS、染料、緩沖體系。密度成分幫助樣品沉入凝膠孔中，SDS是一種陰離子去污劑，染料則用于指示電泳的進(jìn)展。對(duì)于還原蛋白電泳，還需在上樣緩沖液中加入還原劑，降低二硫鍵的生成。
| 組分 |
Tris HCl |
甘油 |
SDS |
溴酚藍(lán) |
二硫蘇糖醇（DTT） |
去離子水 |
(pH 6.8) |
| 濃度 |
63 mM |
10% |
2% |
0.00% |
0.1 M（還原蛋白電泳） |
— |
|
上樣緩沖液組分
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| T105291 |
三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl) |
用于分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng),≥99.0%(AT) |
1185-53-1 |
100g,500g |
| G118851 |
甘油 |
無菌,for molecular biology |
56-81-5 |
100ml |
| S108346 |
十二烷基硫酸鈉(SDS) |
電泳專用,≥98.5% (GC) |
151-21-3 |
25g,100g,500g，2.5Kg |
| B109645 |
溴酚藍(lán) |
Indicator |
115-39-9 |
10g,25g,50g |
| D104861 |
DL-二硫蘇糖醇(DTT) |
用于電泳,≥99% |
3483-12-3 |
1g,5g,25g |